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　　早产儿比足月儿更容易出现运动障碍。在新生儿脑损伤的慢性亚致死性缺氧（Hx）小鼠模型中，我们最近证明了小脑白质中存在细胞和生理变化。我们还观察到 Hx 诱导的浦肯野细胞（PC）树突分支延迟。然而，这些细胞改变的行为后果仍未被探索。使用伊拉斯谟阶梯研究小脑行为，我们报告了 Hx 小鼠存在运动表现不佳和长期小脑学习缺陷。对 Hx 小鼠的光遗传学实验揭示了自发和光诱发的 PC 放电频率大幅降低。最后，用 γ- 氨基丁酸（GABA）再摄取抑制剂治疗部分挽救了运动表现并改善了 PC 放电。我们的结果证明了在新生儿脑损伤的小鼠模型中，存在以运动表现不佳和小脑学习缺陷为特征的长期不协调表型。我们的发现还表明，发育中的 GABA 网络是早产儿相关运动缺陷的潜在治疗靶点。

　　早产会阻碍大脑在妊娠晚期正常发生的生长和发育。小脑在妊娠晚期尤其会快速发育，大小几乎增加三倍，小脑皮质表面积增加 30 倍，同时叶状结构增加。在细胞水平上，浦肯野细胞（PC）层以及外颗粒细胞层分别表现出持续分化和快速细胞分裂。因此，早产会极大地影响小脑发育及相关行为。这在对早产儿的研究中得到了证实，研究记录了从婴儿期到青春期，再到青年期，甚至成年期，早产儿存在严重的运动和认知障碍。

　　在早产儿大脑中发现的两种日益常见的损伤类型是弥漫性白质损伤和大脑皮质（灰质）体积减少。早产儿大脑灰质和白质异常的一个既定原因是由于呼吸系统脆弱和发育不全导致的缺氧性损伤。由于小脑在妊娠晚期快速发育，它特别容易受到缺氧性损伤。一些动物模型研究证实，早产儿的小脑皮质受到缺氧性损伤。在啮齿动物中，出生后前两周的小脑发育相当于人类妊娠晚期的小脑发育时间线。在这个发育时间窗口内，会发生多种短暂的电路水平修饰。重要的发育修饰涉及 PC，它是小脑皮质的主要神经元。因此，人们普遍认为，PC 电路的正常成熟是后期正常小脑行为所必需的。然而，在电路成熟过程中，新生儿脑损伤引起的 PC 生理学特定方面的改变与小脑行为异常之间的关系尚未明确。

　　我们和其他研究人员已经表征并利用了慢性围产期缺氧（Hx）小鼠模型，该模型忠实地再现了人类婴儿新生儿脑损伤的细胞和形态特征。在这个模型中，小鼠在出生后第 3 天到第 11 天（P3–P11）处于低氧环境中饲养，导致灰质和白质体积减少，这是神经发育迟缓的典型特征。随后是恢复期，在此期间，皮质体积在成年期达到常氧（Nx）水平。然而，缺氧性脑损伤的一些方面仍然存在，包括大脑灰质和白质区域中特定神经元和神经胶质细胞群体的发育异常，以及抑制性 γ- 氨基丁酸（GABA）神经传递的破坏，这与在人类中观察到的情况类似。多个实验室获得的证据强烈表明，小脑异常至少部分是由于成人大脑中涉及神经元和神经胶质细胞的 GABA 信号缺陷所致。在发育中的大脑中，GABA 发挥着不同的作用，包括神经元兴奋和营养信号传导。然而，神经发育过程中 GABA 信号的潜在破坏作为新生儿脑损伤导致行为异常的一个致病因素尚未被研究。

　　最近，我们已经证明，慢性围产期 Hx 后，小脑白质（WM）中会发生剧烈的细胞和生理变化。具体的改变包括髓鞘形成不足，少突胶质前体细胞的生理特征变化，以及 GABA 能中间神经元的变化。重要的是，我们还观察到小脑灰质的变化，包括 GABA 能中间神经元的大量丢失，以及 Hx 后 PC 树突分支的急剧减少，PC 的轴突是小脑皮质的唯一输出，对运动表现和运动学习至关重要。小脑皮质中的这些细胞和形态变化与 PC 放电特性的变化相关，表明 Hx 病理生理学的一个潜在特征。

　　在本研究中，我们试图确定 Hx 引起的小脑损伤的特定行为和体内生理后果。最佳的小脑功能对于正常的运动表现以及有效的运动学习至关重要。因此，小脑电路的破坏会导致运动表现不佳和相关运动学习缺陷。为了确定小脑行为的潜在变化，我们使用了伊拉斯谟阶梯（图 1），这是一种全自动的计算机化行为装置，允许在正常生理条件下或损伤后（例如慢性围产期 Hx 后）详细分析和量化小鼠的运动表现和小脑运动学习。我们的结果表明，Hx 后 2 周，小鼠在运动表现以及条件性、适应性运动学习方面的表现明显比 Nx 对照组差。Hx 后 5 周仍可检测到学习延迟。由于异常的小脑学习和运动行为与 PC 的发育和生理完整性直接相关，我们对 Hx 动物进行了体内光遗传学实验，并结合多电极阵列记录。我们的电生理实验揭示了自发和光诱发的 PC 放电的深刻变化。最后，用 GABA 再摄取抑制剂噻加宾（Tiagabine）治疗部分改善了运动表现并提高了 PC 放电频率。我们的研究系统地量化并治疗了 Hx 引起的特定小脑行为缺陷，并在新生儿脑损伤的动物模型中提供了与病理生理学的潜在联系。

　　图1. 实验设计和伊拉斯谟阶梯测试。a. 实验设计示意图。P2 时将 C57BL/6 幼崽与 CD-1 母鼠交叉寄养，P3 - P11 期间进行缺氧饲养（Hx），Nx 为常氧对照。P12 - P16 期间，噻加宾治疗组腹腔注射噻加宾，对照组注射生理盐水。在 P25 和 P45 时进行伊拉斯谟阶梯测试。b. 伊拉斯谟阶梯上的刺激示意图。非条件刺激（US）为阶梯上随机激活的障碍物；条件刺激（CS）为高音警告音。c. 伊拉斯谟阶梯测试的 session 安排。训练 session（sessions 1 - 4）包含 42 个无障碍物挑战的 “未扰动” 试验。挑战 sessions（sessions 5 - 8）中，试验分为 US-only、CS-only 和配对试验，刺激间隔为 250 毫秒。

　　由于人类小脑损伤会导致运动不协调，我们在缺氧饲养后 2 周（P25）测试了小鼠的运动协调缺陷。在训练 sessions 1 和 2 中，Hx 小鼠与 Nx 小鼠相比表现出严重的运动表现不佳（图 2a）。平均而言，Nx 对照小鼠在 session 1 中的失误率仅为 1.7±0.3%（SEM，n = 8 只动物），而 Hx 小鼠的平均失误率为 17%±2.1%（n = 11 只动物）。在 session 2 中，虽然 Hx 和 Nx 小鼠与 session 1 中的表现相比失误率都有所降低，但 Hx 小鼠的失误率仍然明显高于 Nx 对照组，Nx 对照组的失误率降至 1%（0.7±0.2% SEM）（P 0.0001）。然而，从 session 3 到训练结束，Hx 和 Nx 之间的失误率差异在统计学上不显著（所有比较中 P 0.05）。即使在挑战 sessions 5 到 8 中，当 Hx 小鼠面对与前置警告音配对的障碍物时，它们的失误率与 session 1 相比相对较低（图 2a）。与后退步百分比的差异相比，失误率百分比的差异在两组之间更大，后退步百分比可视为完成试验的动机的一种衡量标准（图 2a，b）。多重比较测试表明，Hx 和 Nx 后退步百分比之间在统计学上有显著差异的唯一 session 是 session 2，Hx 小鼠记录的后退步平均不到 1.5%（图 2b）。这表明，Hx 小鼠的失误率较高恰当地表明了它们在运动表现上的差异，因为 Hx 和 Nx 之间的动机差异最小。因此，尽管 Hx 小鼠开始时的失误率较高，但与 Nx 对照组相比，它们最终的表现相对较好。

　　图2. Hx 导致运动表现不佳和步态模式改变。a. P25 时，Hx 组在伊拉斯谟阶梯上的失误率显著高于 Nx 组。b. P45 时，Hx 组的失误率也高于 Nx 组。c. P25 时，Hx 组的后退步数量与 Nx 组的比较。d. P45 时，Hx 组的后退步数量与 Nx 组的比较。e. P25 时，Hx 组和 Nx 组的步长时间分布。f. P45 时，Hx 组和 Nx 组的步长时间分布。g. P25 时，不同步长分类（短步、中步、长步）的百分比，Hx 组短步百分比增加。h. P45 时，不同步长分类的百分比，Hx 组短步百分比仍然较高。

　　小脑损伤特别会改变人类患者学习适应性运动的能力。因此，我们使用伊拉斯谟阶梯系统测试了 Hx 小鼠的适应性小脑学习缺陷。在 sessions 1 到 4（训练）期间，Hx 和 Nx 组的扰动后步长时间没有显著差异（图 3a）。然而，在 P25 开始训练的 Hx 小鼠在小脑学习方面表现出明显的缺陷，证据是在 session 5 中，与 Nx 对照组（黑色实线）相比，扰动后步长时间（红色实线）存在显著差异。这种扰动后步长时间的差异在随后的挑战 sessions 中持续存在。在学习范式结束时，较年轻的 Hx 小鼠的扰动后步长时间仍然明显高于年龄匹配的 Nx 小鼠（图 3a）。

　　图3. 年龄相关的运动适应差异。a. P25 时，Nx 组在多个 sessions 中更快地适应阶梯上的障碍物，而 Hx 组适应较慢。b. P45 时，Nx 组和 Hx 组的适应情况，Hx 组适应能力仍然受损。c. P25 时，不同 sessions 中扰动后步长时间的标准化值，Hx 组恢复到正常步长时间的速度较慢。d. P45 时，不同 sessions 中扰动后步长时间的标准化值，Hx 组与 Nx 组的比较。

　　由于这些测量是绝对比较，有可能虽然这些差异在统计学上显著，但学习的相对变化可能仍然不显著。为了比较学习的相对变化，我们将个体小鼠的扰动后步长时间标准化为同一小鼠在训练最后一天记录的扰动后步长时间（图 3b）。尽管标准化学习值等于或小于零表示相对学习较高，但大于零的值表示相对学习较低。使用这些指标，我们观察到 Hx 组的平均标准化学习值始终高于零，表明相对学习较低，而 Nx 动物的标准化值明显较低，表明相对学习较好（图 3b）。

　　除了比较各组之间的步长时间外，我们还比较了各组内扰动前和扰动后的步长时间。我们发现，在 Nx（黑色迹线）和 Hx（红色迹线）组中，第一次挑战 session 期间，扰动前（虚线迹线）和扰动后（实线迹线）的平均步长时间之间存在统计学显著差异（图 3a）。在随后的 sessions 中，Nx 组的扰动前和扰动后平均步长时间之间的差异减小，从 sessions 6 到 8，这种差异在统计学上不显著。然而，对于 Hx 组，扰动前和扰动后平均步长时间的统计学显著差异一直持续到 session 8（图 3a）。

　　由于扰动前和扰动后步长时间之间的差异表明动物学习避开障碍物的容易程度或 “运动流畅性”，我们测试了 Hx 组中扰动前和扰动后步长时间差异的时间范围。我们假设延长挑战 session 会促进学习，最终导致 Hx 组内扰动前和扰动后步长时间之间的差异很小。因此，我们设计了一个阶梯范式，增加了四个挑战 sessions，我们将其称为 “扩展挑战范式”，如图 1a 中的 “范式 2” 所示。与我们的预测相反，我们观察到，在扩展挑战 sessions 中，Hx 动物的扰动前和扰动后平均步长时间之间仍然存在显著差异，即使在 session 12 也没有解决（图 3c）。在 session 8 中，Nx 组的扰动后平均步长时间为 194±22.7 ms，扰动前步长时间为 141.4±8.6 ms，差异为 52.6±14 ms。相比之下，Hx 组在 session 12 中，扰动后平均步长时间为 279.2±26.8 ms，扰动前平均步长时间为 162.6±17.5 ms，步长时间差异为 116±32 ms。同样值得注意的是，Hx 小鼠在 session 12 中的平均扰动后步长时间甚至高于 250 ms 阈值，而正常小鼠平均在 session 6 时（190.5±29 ms）调整它们的运动以在阈值内避开障碍物。总之，慢性围产期 Hx 导致显著的适应性小脑学习缺陷，即使在促进学习的扩展挑战后也无法解决。

　　由于新生儿脑损伤对运动、认知和行为结果具有长期影响，我们测试了慢性围产期 Hx 对未经历过类似损伤的小鼠适应性小脑学习的影响，在缺氧饲养后 4.9 周（图 1a，范式 3）。在挑战的第一天，P45 Nx 小鼠的扰动后平均步长时间为 423.7±70.3，而 Hx 小鼠的扰动后步长时间更高，为 563.2±61.5，表明在第一次挑战 session 中存在适应性小脑学习缺陷（图 4a）。当比较 Hx 和 Nx 之间的标准化学习时，这种缺陷更加明显（图 4b）。与 P25 Hx 组相比，P45 Hx 动物与年龄匹配的 Nx 动物相比，扰动后步长时间的差异较小。多重比较假设测试表明，在随后的 sessions 中，使用绝对和标准化指标，Hx 和 Nx 组的扰动后步长时间之间没有显著差异。总之，虽然较老的 Hx 动物最终在后期 sessions 中表现出与 Nx 动物相当的小脑学习能力，但 Hx 组中仍然观察到显著的适应性运动缺陷。

　　由于损伤或遗传原因导致的小脑损伤或功能障碍与多关节肢体控制和肢体内协调异常相关，导致步态模式的改变。因此，我们试图使用阶梯的步分类系统（图 1b，“短步”）确定 Hx 动物步态模式的变化。步长的减少是具有小脑步态缺陷的小鼠的典型特征。步长减少是一种补偿机制，可降低人类跌倒的可能性。因此，我们对 P25 和 P45 组在训练和挑战 sessions 期间的短步进行了起点和终点分析（图 5）。我们的分析揭示了不同年龄的 Hx 小鼠的运动步态模式发生了改变，与 Nx 动物有一些关键的相似之处。首先，我们观察到在训练 session 开始时，基础步态模式呈负相关；在 Nx 动物中，比较 P25 和 P45 组时，短步的百分比增加（图 5a）。相反，对于 Hx 动物，比较 P25 和 P45 组时，短步的百分比减少。其次，在训练结束时，Nx 和 Hx P25 组的短步百分比非常相似（图 5b）。然而，在 Nx 和 Hx P45 组中，即使 Hx 动物在两个 sessions 中的短步百分比都较高，训练后短步模式似乎没有差异变化（图 5a，b）。

　　图5. 步态模式的年龄相关变化和 Hx 的影响。a. P25 时，Nx 组和 Hx 组的步态模式，Hx 组显示出 “追赶” 效应，短步百分比在后期接近 Nx 组。b. P25 时，不同 sessions 中短步百分比的变化，Hx 组在最后一次挑战 session 中 “追赶” 效应消失。c. P45 时，Nx 组和 Hx 组的步态模式，Hx 组的步态模式持续改变。d. P45 时，不同 sessions 中短步百分比的变化，Hx 组的短步百分比仍然较高。

　　在挑战 sessions 期间，P25 和 P45 Hx 组的短步百分比都降低了，而两个年龄的 Nx 组的短步要么略有增加，要么相对相似（图 5c，d）。因此，较年轻的 Hx 动物的运动步态模式在训练过程中显示出趋向正常行为的趋势，然而，在挑战 sessions 结束时，这种趋势逐渐逆转。在较老的 Hx 动物中，训练 sessions 期间的步态模式相对保持不变（约 80%）。在挑战 sessions 期间，较老的 Hx 动物的短步百分比降低到 60%，但仍然显著高于较老的 Nx 组（图 5c，d）。

　　由于我们观察到运动表现和适应性小脑学习存在显著缺陷，我们试图确定 Hx 动物小脑皮质中行为异常的潜在生理基础。以前，我们观察到 Hx 后小鼠小脑白质中 GABA 能中间神经元的突触活动异常。然而，从行为学角度来看，功能失调的 PC，而不是白质中间神经元，是适应性运动功能障碍更直接的来源。由于 PC 是小脑皮质的唯一输出，PC 放电功能障碍可能是异常运动行为的关键决定因素。从许多研究中可以清楚地看出，遗传和损伤相关的运动缺陷都源于 PC 功能或发育异常。

　　在我们之前的研究中，我们还证明了 Hx 后 PC 的放电率显著降低。然而，这些记录是在小脑切片上进行的。因此，我们决定使用更完整的体内方法，在 Hx 后的后期年龄中确认我们早期在 PC 中的发现并扩展我们的研究。重要的是，由于 PC 在小脑学习电路中起着重要作用，我们还试图定义 Hx 后诱发放电的潜在变化。因此，我们决定首先使用我们的体内设置确定 Nx 产后发育过程中 PC 放电频率的调节和可塑性。我们在 P13 和 P21 时从先前注射了 Cre 依赖的通道视紫红质 - mCherry（ChR2-mCherry）腺病毒的 Pcp2-Cre 小鼠（Mpin 系）的小脑皮质中获取了 PC 的体内多电极阵列（MEA）记录（图 6a，b）（见方法）。我们计算了两组 PC 的简单 spike 放电频率，并分析了光刺激开始前和开始后 2 秒总时间内的自发活动以及诱发（光刺激）活动（t = 0），如图 6c，d 所示。光刺激总时长为 1000 ms（图 6a–d，蓝色线 时 Nx 和 Hx 在 2 秒时间窗口内的平均基础放电频率（光刺激开始前 1 秒和光刺激开始后 1 秒；“光刺激” 开始意味着在放电频率与时间图中 t = 0），发现各组之间存在统计学显著差异（图 6e）。诱发放电的变化结果将在以下子部分详细说明。比较 Nx 动物在 P13（黑色）和 P21（蓝色）时的情况，PC 显示出自发 / 基础放电频率增加。在 Nx 条件下，PC 的平均基础放电频率从 P13 时的 27.83 Hz（图 6e，黑色空心圆）增加到 P21 时的 55.09 Hz（蓝色空心圆）。相比之下，Hx 后，P13（红色空心圆）和 P21（酒红色空心圆）的 PC 与年龄匹配的 Nx 对照组相比，基础放电频率严重降低。这表明，P13 到 P21 的发育时间不足以使自发活动内源性地恢复到与年龄匹配的 Nx 动物的放电频率水平。此外，P13 和 P21 Hx 组之间的基础放电没有统计学显著变化（图 6e）。

　　图6. 光遗传学刺激下 PC 的放电特性。a. 体内光遗传学刺激示意图，将 AAV9-DIO-ChR2-mCherry 注射到 Pcp2-Cre 小鼠的小脑皮质，使用 473 nm LED 光刺激。b. P13 和 P21 时，Nx 组 PC 的代表性电生理记录，显示光刺激诱发的尖峰活动。c. P13 和 P21 时，Hx 组 PC 的代表性电生理记录，光刺激诱发的尖峰活动减少。d. P13 和 P21 时，Nx 组和 Hx 组 PC 的基础放电频率比较，Hx 组基础放电频率降低。e. P13 和 P21 时，Nx 组和 Hx 组 PC 的诱发放电频率比较，Hx 组诱发放电频率显著低于 Nx 组。

　　我们使用伊拉斯谟阶梯的行为结果清楚地表明 Hx 小鼠的步长时间异常（图 3 和 4）。PC 的兴奋性与关联运动学习的时间方面有关。重要的是，新出现的证据强烈表明，PC 本身的活动（无论攀爬纤维（CF）输入如何）都可以驱动运动技能学习。因此，我们试图通过使用通道视紫红质介导的光刺激来确定 Hx 和 Nx 动物中神经元的兴奋性。我们开发并优化了立体定向通道视紫红质 - mCherry（AAV9-DIO-ChR2-mCherry，补充图 1a）腺相关病毒注射到幼年 Pcp2-Cre 小鼠（P9）的小脑皮质中，在注射后 4 天内获得了强大的 ChR2-mCherry 表达（补充图 1b，c）。为了确保新生儿 Hx 治疗和 ChR2-mCherry AAV 注射后 PC 的活力和反应性，我们进行了体外切片电生理学研究，在其中我们分析了被动特性（补充表 1）和对蓝光刺激的反应（补充图 2）。我们的结果表明，Hx PC 在电生理学上是可行的（补充图 2a–f），没有显示出被动特性的改变（补充表 1），并且对光刺激的反应与 Nx PC 相似（补充图 2g–j）。最后，我们还在形态学上（补充图 3）和功能上验证了病毒表达的细胞特异性，以及 Pcp2-Cre Mpin 小鼠小脑皮质对光遗传学刺激的光反应。为了解决我们实验中光反应的潜在非特异性（所有这些实验都涉及将 AAV 注射到 Pcp2-Cre Mpin 小鼠小脑皮质的特定区域），我们从 mCherry+ PC 附近的随机选择的分子层中间神经元记录，同时进行蓝光刺激。与 mCherry+ PC 对光刺激的直接和强大的功能反应相比（补充图 4a），我们观察到我们记录的分子层中间神经元（MLIs）在应用光刺激时没有光电流（来自五只小鼠的 19 个 MLIs 中 0 个；补充图 4b）。我们通过电流注射协议确保了 MLIs 的动作电位发放能力（补充图 4c）。因此，尽管我们观察到罕见的 mCherry+ MLIs 实例，但 mCherry+ PC 附近的 MLIs 在光刺激后缺乏光电流表明我们的病毒策略和光刺激范式在功能上对 PC 反应具有选择性。

　　我们在定义的光刺激时间窗口内进行了体内放电频率分析，总时长为 1000 ms，如图 6a–d 中浅蓝色条所示。我们发现，P13 Nx 和 P21 Nx 组中 PC 的诱发放电活动明显高于各自的基础放电率（图 6e）。我们还观察到，P21 Nx 动物中 PC 的诱发放电频率明显高于 P13 Nx 动物（图 6e）。然而，令人惊讶的是，Hx PC 即使在相同的光刺激范式下也未能诱发中等高水平的尖峰活动（图 6a–e），尽管在病毒注射的 P13 Hx 和 P21 Hx 小鼠的 PC 中 ChR2-mCherry 融合蛋白表达强劲（补充图 5a）。P13 和 P21 Hx 组的体内诱发放电频率满足我们的细胞选择标准（第一次刺激后 1000 ms 的平均诱发放电频率 第一次刺激前 1000 ms 的平均基础放电频率 + 1 S.D.）（补充图 5b，c）。最后，我们确认电极位置在 PC 胞体层（补充图 5，b 和 c 中的插图）。

　　我们发现，Hx 小鼠组（两个年龄组）的诱发放电增加明显弱于年龄匹配的常氧对照组在相同的光刺激范式下的情况。我们还发现，两个年龄组的 Hx 动物中，诱发和基础放电率之间没有统计学显著差异（图 6e）。平均放电频率从 4.3 Hz（基础）变为 6.43 Hz（光刺激）和 6.85 Hz（基础）变为 9.55 Hz（光刺激），分别适用于 Hx P13 和 Hx P21，这表明 Hx 后 PC 的功能恢复趋势延迟。

　　以前，我们报告说，在慢性围产期 Hx 后立即增加神经递质 GABA 的水平可以挽救小脑白质中少突胶质前体细胞分化和 GABA 能中间神经元数量及生理学的细胞变化。然而，GABA 再摄取抑制剂的药理学干预是否转化为对行为的可观察到的影响尚未被探索。在这里，我们使用了类似的干预范式，我们在 P12 到 P16 期间每天一次腹腔注射 GABA 再摄取抑制剂噻加宾（Tiagabine）（图 1a）。然后，我们使用阶梯范式测试了噻加宾对缺氧饲养后 2 周运动表现的影响（图 7）。总体而言，噻加宾治疗组和对照组之间存在明显的干预效果和 session 效果。我们观察到噻加宾治疗组在第一次 session 中的失误率略有下降，但在统计学上不显著（图 7a，绿色迹线）。然而，在 session 2 中，治疗组的失误率急剧下降，且在统计学上显著，治疗组的失误率为 2.6±0.85%，而生理盐水 Hx 组的失误率为 9.3±2.28%（图 7a）。在接下来的 session 3 中，噻加宾治疗的动物失误率继续下降，失误率仅为 1±0.16%。在挑战 sessions 5 到 7 中，治疗组的失误率仍然较低，尽管在统计学上不显著（图 7a）。然而，在最后一次挑战 session 中，失误率在统计学上有显著差异，治疗组的表现优于生理盐水治疗组。虽然我们观察到总体的 session 效果，但我们对后退步的内部对照测量显示治疗组和对照组之间没有干预效果。多重比较测试表明，治疗组和未治疗的 Hx 组在任何 session 中后退步的差异在统计学上不显著（图 7b），这表明治疗组在运动方面有特定的改善。最后，我们还监测了噻加宾治疗对适应性小脑学习的影响（补充图 7）。有趣的是，与生理盐水对照组相比，我们在 P25 和 P45 治疗组中没有观察到小脑学习的任何改善。与 P45 的行为观察一致，P45 的体内电生理学表明，Hx 导致 PC 简单尖峰放电模式的长期减少（补充图 8）。总之，我们观察到噻加宾治疗后 Hx 动物的运动表现有显著改善，但对适应性小脑学习没有改善。

　　图7. 噻加宾治疗对运动表现的影响。a. P12 - P16 期间腹腔注射噻加宾，P25 时在伊拉斯谟阶梯上的失误率，治疗组在 session 2 及以后失误率显著降低。b. P12 - P16 期间腹腔注射噻加宾，P25 时在伊拉斯谟阶梯上的后退步数量，治疗组和对照组之间没有显著差异。

　　为了将噻加宾干预后 Hx 动物运动表现的行为挽救与病理生理学相关联，我们使用了体内光遗传学和电生理学，如前所述。我们决定在 P30 动物中进行电生理学分析，因为这个时间点在分析较年轻的 Hx 动物（P25–P33）的时间范围内，我们在伊拉斯谟阶梯上观察到对小脑学习和运动表现的显著影响。我们发现噻加宾治疗部分改善了 PC 放电的一九游科技些特征。我们首先观察到，与 Nx 30 PC 相比，P30 Hx 组的 PC 基础和诱发放电频率显著降低（图 8c，分别比较黑色空心和实心圆与红色空心和实心圆）。然而，与未治疗的 Hx 组相比，噻加宾治疗的 P30 Hx 组的基础和诱发放电频率显著提高（图 8c，比较红色空心和实心圆与绿色空心和实心圆）。分析表明，噻加宾治疗的 Hx 组和未治疗的 Nx 组之间在基础和诱发放电频率上存在统计学显著差异（图 8c，分别比较绿色空心和实心圆与浅棕色空心和实心圆），这表明我们的药理学干预范式部分挽救了 PC 放电频率。我们还注意到噻加宾治疗可能对 Nx 动物的 PC 放电有影响（图 8a–c）。这种影响仅限于基础 PC 放电，不影响诱发放电频率。

　　图8. 噻加宾治疗对 PC 放电特性的影响。a. P30 时，Nx 组、未治疗的 Hx 组和噻加宾治疗的 Hx 组 PC 的基础放电频率比较，噻加宾治疗部分恢复了 Hx 组 PC 的基础放电频率。b. P30 时，Nx 组、未治疗的 Hx 组和噻加宾治疗的 Hx 组 PC 的诱发放电频率比较，噻加宾治疗对诱发放电频率的恢复效果有限。c. 不同组 PC 的基础和诱发放电频率的详细数据，包括个体细胞的数据点和组均值。d. 不同组 PC 放电的变异系数（CV）比较，未治疗的 Hx 组 CV 值较高，噻加宾治疗部分降低了 CV 值。e. 不同组 PC 放电的 CV2 比较，未治疗的 Hx 组与其他组存在差异，噻加宾治疗的 Hx 组 CV2 值有所改善。

　　最后，我们发现，在比较平均 CV 值时，治疗和未治疗的 Hx 和 Nx 组之间存在总体统计学显著差异（图 8d），但组间 CV 差异不显著。我们注意到 CV2 值在组间和组内都存在差异（图 8e）。未治疗的 Hx 组与未治疗的 Nx 组和噻加宾治疗的 Nx 组相比，CV2 存在统计学显著差异。然而，噻加宾治疗的 Hx 组的 CV2 与未治疗的 Nx 组或噻加宾治疗的 Nx 组相比，在统计学上不显著。这向我们表明，噻加宾治疗后 Hx 小鼠的 PC 放电节律有改善的趋势。在尖峰轮廓分析中也观察到了这种趋势，表明噻加宾治疗组的轮廓得到了改善（补充图 6e–h）。总之，伊拉斯谟阶梯数据和体内电生理学结果表明，噻加宾部分挽救了运动表现不佳，这可能是由于 PC 放电的特定特征得到改善，如基础简单尖峰放电频率、放电节律和平均简单尖峰持续时间。

　　PC 的电生理学记录表明，复杂尖峰主要负责小脑学习中的适应性条件反应。由于伊拉斯谟阶梯使用条件学习范式，我们分析了复杂尖峰模式，这可能是我们观察到的行为缺陷的潜在原因。我们从 P30 Nx 和 Hx 的放电数据中对 PC 复杂尖峰进行了分类（图 9a–c），并分析了治疗和未治疗的 Nx 和 Hx 组的基础和诱发复杂尖峰放电模式（图 9d，e）。第一个复杂尖峰的中位潜伏期为 139 ms，而简单尖峰潜伏期为 6 ms（补充图 9）。我们发现治疗和未治疗组之间在平均基础和诱发放电频率上存在总体统计学差异（图 9f）。比较 Nx 和未治疗的 Hx 组，我们报告了平均诱发复杂尖峰放电频率的组间统计学显著差异。然而，与我们对组间简单尖峰放电的观察相反，我们没有观察到 Nx 和未治疗的 Hx 组之间平均基础复杂尖峰放电频率的显著差异。噻加宾治疗实际上将平均诱发复杂尖峰放电频率恢复到接近正常水平。虽然我们没有观察到治疗和未治疗的 Hx 和 Nx 组之间平均基础复杂尖峰放电频率的显著组间差异，但我们确实观察到了 CV 值或基础复杂尖峰放电规律性的差异。与 Nx 组相比，Hx 组的平均 CV 值更高（图 9g）。噻加宾治疗的 Hx 组中平均 CV 的增加恢复到接近正常水平。我们没有观察到各组之间基础复杂尖峰放电节律的改变（图 9h）。总之，我们的复杂尖峰分析表明，诱发复杂尖峰放电频率和规律性的改变在噻加宾治疗的 Hx 动物中恢复到接近正常水平。

　　图9. 药理学干预使体内 Hx 小鼠的复杂尖峰放电恢复到接近正常水平。a. 来自未处理的 P30 Nx（黑色）、噻加宾处理的 P30 Nx（浅棕色）、未处理的 P30 Hx（红色）、噻加宾处理的 P30 Hx（绿色）的代表性多电极阵列（MEA）记录，显示复杂尖峰（CSs）（星号）。比例尺为 500 毫秒。c. 与 a 中框内尖峰对应的代表性复杂尖峰，以更高分辨率显示。星号标记复杂尖峰的主要尖峰，随后是特征性的小尖峰。d. 来自未处理的 Nx（黑色，n = 28 个 PC，SEM—— 浅灰色）、噻加宾处理的 Nx（浅棕色，n = 28 个 PC，SEM—— 浅棕黄色）、未处理的 Hx（红色，n = 9 个 PC，SEM—— 浅红色）和噻加宾处理的 Hx（绿色，n = 19 个 PC，SEM—— 浅绿色）组的 P30 动物的平均复杂尖峰频率，每组从 8 到 10 只动物中获取数据。f. 如 a 和 b 中的图例所示的各组间复杂尖峰频率比较的散点图。对于所有组，空心圆代表基础放电，实心圆代表诱发（光刺激）放电。每个圆代表从每组多个细胞中获取的单个样本的平均放电频率。在光刺激前采样 10 个连续时间点，在光刺激后采样 11 个连续时间点。每组中的水平线代表跨时间样本的平均放电频率。单向方差分析，F (7,76) = 31.86，P 0.0001，R² = 0.7458。g. Nx 和 Hx 动物基础 PC 放电的峰间间隔变异系数（CV）值的散点图。每个菱形代表来自在 d-f 中分析的同一组 PC 的个体 CV 值。（单向方差分析，F (3,79) = 7.378，P = 0.0002，R² = 0.2189）。h. 与 d-f 中相同数据集的 Nx 和 Hx 动物基础 PC 放电的 CV2 散点图。（单向方差分析，F (3,66) = 1.898，P = 0.1386，R² = 0.07941）。a 和 b 中的比例尺为 500 毫秒。b-e 中的误差线表示标准误。星号代表单向方差分析后 Tukey 多重比较检验的结果，*P 0.05，***P 0.001，****P 0.0001，n.s.—— 不显著。

　　我们已经在与临床相关的新生儿脑损伤小鼠模型中证明了运动表现不佳、小脑学习缺陷和体内 PC 生理学异常的存在。我们的研究包括对 Hx 诱导的新生儿脑损伤中运动行为和小脑学习的严格客观分析。使用先进的伊拉斯谟阶梯行为系统，我们表明 Hx 动物存在运动不协调、长期小脑学习缺陷和改变的运动步态模式。我们的研究还采用体内多电极记录和光遗传学来定义新生儿脑损伤病理生理学的关键特征。我们发现，Hx 小鼠的 PC 在基础和诱发条件下的简单尖峰放电频率在不同的发育时间点均显著降低。最后，我们提供了证据，证明靶向发育中的 GABA 系统在改善 Hx 诱导的运动表现缺陷方面的药理学功效。Hx 后立即用 GABA 再摄取抑制剂噻加宾治疗导致与对照组相比失误率显著降低。与未治疗的动物相比，用噻加宾治疗的 Hx 动物还显示出改善的 PC 简单尖峰和复杂尖峰放电模式。本研究的结果为将小脑行为的特定改变与新生儿脑损伤引起的细胞和生理变化联系起来提供了潜在的机制基础。因此，我们结合使用自动化量化小脑介导的行为和体内光遗传学 - 电生理学分析的双向方法，为评估针对早产儿相关运动障碍的靶向治疗的功能提供了临床前平台。

　　小脑皮质的正常发育确保了后期对感觉运动行为的精确时空控制。由于损伤导致的发育中断或延迟会导致运动行为异常。我们在 Hx 小鼠中观察到的运动表现不佳与在早产儿中观察到的运动缺陷有显著的相似之处。对涉及人类受试者的 41 项研究的荟萃分析显示，极早产儿（妊娠 32 周）的运动技能发育存在显著损害。因此，小脑损伤由于步态障碍、肢体间和肢体内协调不良以及感觉信息整合缺陷，导致基础和适应性运动评估结果不佳。动物模型的最新报告为小脑对步态行为的动态实时控制提供了有力证据，当选择性操纵小脑皮质中的不同细胞类型（包括 PC）时，这种控制会发生改变。在这种情况下，我们观察到 Hx 小鼠的失误率显著更高，这与这些研究结果相关，并进一步验证了我们的模型在研究主要影响小脑处理的运动障碍方面的临床相关性。

　　除了跑步或行走等基础运动行为外，来自人类患者的数据清楚地表明，小脑损伤也会显著损害适应性运动学习，这是小脑功能的核心特征。在动物模型中，特征明确且广泛使用的小脑学习范式包括延迟眨眼条件反射和前庭眼反射范式。然而，这些范式具有局限性，不涉及全身运动。我们的研究通过在运动背景下识别适应性小脑学习的特定缺陷，直接解决了新生儿脑损伤的神经后遗症。虽然我们的学习范式也可能检测到条件反应的小脑外调节（调整步长时间以实现最佳避障），但我们的实验设计最大限度地减少了小脑以外区域的贡献可能性。因此，我们使用伊拉斯谟阶梯非常适合梳理运动表现和适应性小脑学习的差异。

　　虽然以前使用阶梯对小脑学习的研究仅在给定实验条件下研究了一个年龄组，或在成年阶段研究了广泛的年龄范围，但我们的研究确定了正常发育小鼠中两个定义年龄组的小脑学习的特定变化，以研究这种功能的发育调节。我们还展示了这些变化如何在 Hx 小鼠中受到神经发育破坏的影响。分析的时间点 P25 和 P45 分别大致对应于儿童期和青春晚期 / 青年早期。我们的数据表明，幼年小鼠在适应路径中随机放置的障碍物方面比年轻成年小鼠更快（图 3a，4a，session 5）。然而，适应步长时间的差异在更多 sessions 中持续存在，这表明我们在 Hx 小鼠中观察到的运动适应缺陷可能是由于发育延迟导致的小脑可塑性丧失。未经历过类似损伤的 P45 小鼠能够适应它们的运动，而 P25 小鼠则不能，这表明通过补偿性电路形成和 / 或延迟的电路成熟产生了替代运动策略。这在步态模式数据中得到了证实（图 5），其中 P25 小鼠表现出 “追赶” 效应，它们 “学习” 使用更高百分比的短步，类似于 Nx 小鼠（图 5b，c）。然而，这种效应在最后一次挑战 session 中消失（图 5d）。有趣的是，P45 Hx 小鼠继续显示出改变的步态模式（图 5c，d），尽管显示出改善的适应性学习（图 4）。因此，新生儿损伤不仅导致适应性学习的年龄相关变化，还导致步态模式的变化。

　　由于 PC 对适应性条件学习反应至关重要，我们针对 PC 的体内研究解决了与使用伊拉斯谟阶梯获得的神经行为读数更密切相关的机制。在这里，我们分析了简单尖峰和复杂尖峰。简单尖峰放电是由 PC 的内在活动以及通过苔藓纤维 - 颗粒细胞连接对 PC 的平行纤维（PF）刺激引起的。复杂尖峰是由 CF-PC 电路活动引起的。因此，随着小脑皮质电路的成熟，简单尖峰和复杂尖峰频率也预计会发生变化。我们观察到 P13 和 P21 Nx 动物之间基础和诱发简单尖峰放电频率的增加（图 6 c–e）与之前对 PC 放电的体内分析结果相当。重要的是，我们观察到 P13、P21（图 6 e）、P30（图 8 c）甚至 P45 Hx 组中基础和诱发 PC 简单尖峰放电频率急剧降低，这一点很重要，因为 PC 放电模式的变化是不同小脑性共济失调小鼠模型的一个重要特征。虽然简单和复杂尖峰放电在共济失调和其他小脑疾病中可能受到影响，但有证据表明，在多种模型中，尖峰放电模式存在差异改变，这可能导致行为缺陷的表现。这些研究的数据表明，Hx 模型中观察到的 PC 简单尖峰放电减少的潜在机制涉及突触输入（外在）的改变或 PC 内在的变化。在我们的数据中，我们发现 Hx 动物中诱发复杂尖峰放电模式发生了变化（图 9），而基础复杂尖峰放电频率保持不变。由于基础和诱发简单尖峰放电在我们的模型中受到显著影响，Hx 可能通过苔藓纤维 - GC 突触影响 PF-PC 通路，或者由于细胞内在变化导致 PC 的自发活动改变。我们的体外电生理学数据表明，Hx 和 Nx 组的 PC 在被动特性方面基本相似（补充表 1）。然而，Hx 和 Nx 之间的电流 - 频率曲线存在显著差异（补充图 2 e–f），Hx PC 的 Y0（0.92 Hz）低于 Nx PC（2.32 Hz），支持基础放电差异可能是细胞内在的观点。

　　在我们之前的研究中，我们表明发育中 [Cl−] 积累共转运体 NKCC1 的破坏模拟了 Hx。有趣的是，最近的一项研究表明，由于 [Cl−] 稳态破坏导致的 PC 简单尖峰放电异常可能是成年突变小鼠在伊拉斯谟阶梯上短步百分比增加的原因。这与我们从 P45 Hx 小鼠获得的行为数据一致，显示与 P45 Nx 小鼠相比短步数量更多（图 5）。然而，与之前引用的研究相反，我们发现 Hx 动物体内简单尖峰活动减少，这表明 [Cl−] 积累速率作为一个模拟调节因子调节简单尖峰生成速率。重要的是，这表明有助于维持 [Cl−] 梯度的因素，如早期 GABA 信号传导，可以作为发育损伤的治疗靶点。

　　以前对神经发育性运动障碍的临床前啮齿动物模型的治疗干预研究通常使用如转棒试验、平衡木试验、倾斜梁试验或墨水 / 染料足迹测定等测试方法。我们使用伊拉斯谟阶梯作为系统来分析靶向发育中的 GABA 系统的治疗干预，以改善运动和小脑学习缺陷。我们的干预时间窗口（P12–P16）跨越了早期发育中去极化 GABA 阶段的滞后末端，进入更成熟的抑制性 GABA 阶段。用 GABA 再摄取抑制剂噻加宾治疗仅通过减少失误来挽救运动表现（图 7a），但不影响适应性小脑学习（补充图 7），这表明早期损伤后立即增加 GABA 会更普遍地影响与运动表现相关的电路或细胞，可能与白质改善有关。

　　与先前的发现一致，潜在影响 Hx 小鼠适应性学习的一个关键因素是 PC 的基础放电率降低。然而，我们的光遗传学数据也表明，在所有研究的年龄组中，PC 的诱发放电率降低（图 6c–e，图 8b，c）。虽然自发 PC 活动对产后发育中小脑电路的形成和运动表现至关重要，但在负责小脑学习的电路机制背景下，通过 PF 的苔藓纤维 - PC 和通过 CF 的下橄榄核 - PC 也很重要，因为这些电路分别编码条件刺激（CS）和非条件刺激（US）在关联小脑学习中。新出现的数据表明，除了 CF 和 PF 小脑系统外，诱发 PC 简单尖峰活动本身也可以驱动某些形式的运动学习，如前庭眼反射（VOR）。然而，鉴于 MLIs 对于通过对 PC 的突触抑制正常获得适应性小脑学习是必要的，我们不能完全排除 MLIs 对我们观察到的异常放电特性的潜在贡献。

　　我们的电生理学数据表明，噻加宾增加了 PC 的基础放电率，这可能反映了涉及 P/Q 型 Ca2 + 通道的起搏活动的改善，从而改善了运动表现。然而，噻加宾治疗并没有显著改善诱发的 PC 简单尖峰放电，这可能解释了为什么噻加宾治疗的 Hx 动物的学习没有改善（补充图 7）。此外，我们的数据显示，噻加宾治疗的动物的适应性学习没有显著改善（补充图 7），结合治疗动物中诱发的复杂尖峰放电模式恢复到接近正常水平（图 9 f），进一步支持了 PC 中错误的简单尖峰生成导致长期适应性小脑缺陷的观点，正如使用伊拉斯谟阶梯所观察到的。虽然我们不能否定 MLIs 的贡献，但可以推测，由于新生儿脑损伤，由 PC 活动驱动的适应性学习和运动协调受到了干扰。需要进一步的实验来解决这个重要问题。虽然噻加宾在新生儿脑损伤的背景下部分恢复 PC 活动可能还有其他机制，但我们的发现表明，GABA 再摄取抑制剂改善了 Hx 引起的生理和行为表型，这表明 GABA 能网络是早产儿相关运动缺陷的潜在治疗靶点。

　　雌性和雄性野生型 C57BL/6 小鼠用于行为实验。雌性和雄性 Pcp2-cre 小鼠（B6.129-Tg (Pcp2-cre) 2Mpin/J；美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室）用于体内光遗传学和多电极阵列记录实验。所有动物的处理均符合儿童国家医疗中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定，该委员会批准了所有方案，以及《实验室动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院）。

　　为了在小鼠模型中模拟新生儿脑损伤的影响，我们使用慢性亚致死性新生儿缺氧饲养。简而言之，P2 C57BL/6 小鼠幼崽与 CD-1 母鼠进行交叉寄养，并在 P3–P11 期间置于缺氧室（10.5% fiO2）中（除非另有说明）。Hx 后，小鼠在短暂适应 Nx 条件后返回标准实验室饲养条件。

　　在两个年龄阶段研究小脑行为 ——P25 和 P45（测试第一天的年龄）。用于行为实验的所有小鼠均为未经历过类似损伤的，且未进行过先前的行为测试。

　　所有测量小脑功能的行为测试均在伊拉斯谟阶梯（ERLA-0010；荷兰瓦赫宁根的 Noldus 信息技术公司）上进行。使用伊拉斯谟阶梯软件（v1.0 和 11）来控制阶梯。我们分别使用默认阶梯协议（图 1a）用于范式 1 和范式 3，以测试 P25 和 P45 时的小脑行为。范式 1 和范式 3 的实验协议包括四个训练 sessions，随后是四个挑战 sessions，每天进行一个 session。每个训练 session（sessions 1–4；图 1c）由 42 个 “未扰动” 试验组成，其中不呈现障碍物挑战。在挑战 sessions（sessions 5–8；图 1c）中，42 个试验以随机顺序呈现 “仅非条件刺激”（US-only）、“仅条件刺激”（CS-only）或 “配对” 类别。对于 US-only 试验，动物面对计算机控制的障碍物（US；图 1b）—— 由随机激活的障碍物组成，在阶梯上的某个点阻挡运动路径。对于 CS-only 试验，在动物位于阶梯上的某个点时随机呈现高音警告音。对于配对试验，呈现 CS，随后是 US，刺激间隔为 250 毫秒（图 1 b，c）。对于范式 2，我们使用标准协议的扩展版本，其中挑战 sessions 的数量从四个增加到八个。

　　为了研究 PC 的放电特性，我们使用体内光遗传学结合多电极阵列记录。对于所有光遗传学实验，我们采用 Cre 依赖的通道视紫红质 - mCherry 腺相关病毒（AAV）（补充图 1a）（AAV9.EF1.dflox.hChR2 [H134R]-mCherry.WPRE.hGH；宾夕法尼亚大学载体核心，目录号 AV-9-20297P），最初由斯坦福大学的 Karl Deisseroth 实验室开发。对于体内细胞外记录，我们使用 1 MΩ 钨电极阵列（8 个电极）（Microprobes MEA，美国 MD），耦合到直径 200 µm 的光纤，连接到 473 nm 波长的 LED 灯（PlexBright LED 4 通道光遗传学控制器，Radiant 软件，版本 2.0，美国 Plexon）。将电极阵列立体定向地（前 / 后 -5.2 mm；中 / 侧 -2.1 mm；背 / 腹 -0.35 mm）插入异氟烷麻醉、头部固定、病毒注射的 Pcp2-cre 小鼠的小脑中，以选择性刺激 PC，同时记录它们的自发和光刺激诱发的尖峰活动。在所有电生理学实验中使用相同的电极位置。

　　东莞市富临塑胶原料有限公司是 Microprobes 在中国的代理商，富临塑胶为中国客户提供金属微电极、多通道阵列、外周电极和技术协助。

　　GABA 能再摄取抑制剂噻加宾（目录号 4256，英国布里斯托尔的 Tocris 公司）稀释在 0.5% 生理盐水中，在 P12–P16 期间通过腹腔注射给予幼崽，剂量为每克体重 50 µg。每天一次注射温热至 37°C 的药物溶液，注射体积为每克体重 10 µl。

　　使用 Prism 6（GraphPad）和 OriginPro 2015（OriginLab）分析从伊拉斯谟阶梯实验获得的数据。使用 Prism 6 进行统计分析。为了比较各组之间的失误和后退步，进行双向方差分析（ANOVA）和 Sidak 多重比较。为了比较组内和组间的步长时间，进行双向重复测量（RM）ANOVA 和 Tukey 多重比较，并报告 P 值。为了获得标准化学习，将个体小鼠记录的扰动后步长时间标准化为同一小鼠在 session 4 期间记录的扰动后步长时间。使用与绝对学习相同的统计测试来比较标准化学习。为了比较不同年龄的步分类，使用双向 ANOVA 和 Tukey 多重比较。对于所有行为实验，使用两个标准来确定从组分析中排除的异常值：session 5 的扰动后步长时间测量，和 / 或最后四个 sessions 中的跳跃百分比。使用 ROUT 方法确定两个标准的异常值（Q = 1%）。对于光遗传学和体内电生理学数据的量化和可视化，使用 Origin 2016（Origin 实验室）。对于电生理学数据分析，使用 Prism 6（GraphPad）。在光刺激前（光刺激前）1000 ms 和光刺激开始后（光刺激后）1000 ms 的时间窗口内分析放电频率。光刺激前和光刺激后的频率采样分别包括 10 个和 11 个连续时间点。使用单向 ANOVA 和 Tukey 多重比较测试进行统计假设检验，并报告多重性调整的 P 值。为了比较电流 - 频率图中的指数拟合参数，使用额外平方和 F 检验比较方程 Y = Y九游科技0e (kX) 中的 Y0 和 k。对于 mCherry + 细胞计数的统计分析，使用双样本或双尾 t 检验。为了比较非 PC:PC 细胞计数比率，使用 Fisher 精确检验。所有统计假设检验的 α = 0.05。报告所有多重比较测试的调整后 P 值。样本大小不是基于统计测试预先确定的，而是基于该领域设定的标准范围。对于行为测试，在某些 sessions（在同一实验中）的少数测量值不遵循正态性测试估计的高斯分布，然而，为了一致性，我们对所有行为实验使用 RM-ANOVA 或双向 ANOVA，因为数据代表来自相同样本的连续测量。所有实验中每组至少使用来自两个窝的动物。无法进行盲法或随机化。由于行为实验是完全自动化的，动物 - 实验者交互偏差可能可以忽略不计。