九游（NINEGAME）娱乐股份有限公司-官方网站

　　利用重组D-氨基酸氧化酶（DAAO）在活体小鼠海马神经元中可控生成过氧化氢并验证其诱导氧化应激的能力。通过D-诺伐琳腹腔注射或饮水递送，结合HyPer7荧光传感器和实时光纤光度计，证实DAAO在活体脑中可有效催化H2O2生成。拉曼显微光谱显示该过程导致线粒体电子传递链负载下降，证实了氧化应激的发生。DAAO/D-诺伐琳组合为研究脑氧化应激相关神经退行性疾病提供了新工具。

　　德米特里·I·马尔采夫（Dmitry I. Maltsev）马克西姆·A·索洛滕科夫（Maxim A. Solotenkov）叶卡捷琳娜·A·埃列西娜（Ekaterina A. Elesina）阿丽莎·A·多尔贝涅娃（Alisa A. Dolbeneva）安娜·A·费多托娃（Anna A. Fedotova）克谢尼娅·I·莫罗佐娃（Kseniia I. Morozova）伊利亚·V·费多托夫（Ilya V. Fedotov）亚历山大·A·拉宁（Aleksandr A. Lanin）安德烈·B·费多托夫（Andrei B. Fedotov）德米特里·A·科尔热涅夫斯基（Dmitry A. Korzhenevskii）亚历山大·A·莫申科（Aleksandr A. Moshchenko）娜杰日达·A·布拉热（Nadezda A. Brazhe）奥列格·V·波德戈尔尼（Oleg V. Podgorny）弗谢沃洛德·V·贝卢索夫（Vsevolod V. Belousov）

　　皮罗戈夫俄罗斯国立研究医科大学（Pirogov Russian National Research Medical University），俄罗斯莫斯科，邮编117997

　　。这种化学遗传学工具为研究氧化应激在衰老相关退行性疾病发生中的作用提供了独特的机会。然而，目前尚未测试过该工具在体内（

　　）诱导大脑氧化应激的效果。在本研究中，我们结合了病毒载体介导的DAAO表达和HyPer7（一种基因编码的H

　　光纤光度测量技术，来检测通过腹腔注射或饮用水给予D-诺瓦林（D-norvaline）后H

　　的化学遗传学生成情况。观察到HyPer7信号强度的变化证实了体内细胞内H

　　的过程中，电子传递链的负载减少了。总之，我们的发现表明，基于DAAO的化学遗传学工具结合通过腹腔注射或饮用水给予D-诺瓦林的方法，适用于在体内诱导慢性氧化应激。

　　合成生物学工具，如光遗传学和化学遗传学，为研究生物体功能背后的分子和细胞机制提供了前所未有的机会[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。这些方法主要应用于细胞生物学、化学生物学和神经科学领域。类似的合成生物学工具能够对关键氧化还原活性分子（如O

　　S [11]、[12]、[13]、[14]、[15]）以及细胞内pH值[16]、[17]进行空间和时间上的控制，从而有助于研究氧化还原信号传导和代谢的基本机制，并验证其失调在各种人类疾病发病机制中的作用。

　　慢性氧化应激是能量消耗器官（如心脏和大脑）中衰老相关病理的标志。目前尚不清楚氧化应激是这些病理的诱因，还是加剧某种未知原发病理的次要因素。为了阐明这一点，需要一种能够单独产生氧化应激的工具。来自酵母

　　的D-氨基酸氧化酶（DAAO）（EC-1.4.3.3）[18]是一种黄素酶，能够催化D-氨基酸的氧化脱氨基反应，可以用于化学遗传学地生成细胞内和细胞器内的过氧化氢（H

　　[13]，[19]，因此可作为产生独立氧化应激的工具。多项证据表明，这种化学遗传学工具可用于建立心力衰竭、感觉性共济失调和血管损伤的

　　模型[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。最近的研究表明，化学遗传学生成的细胞内H

　　会影响体外急性脑切片中的突触可塑性[26]。因此，将这种化学遗传学工具转化为

　　实验范式，有助于研究慢性氧化应激在认知衰老和与衰老相关的神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）中的作用。

　　已知多种D-氨基酸能够穿透血脑屏障（BBB）[27]、[28]、[29]、[30]，并且认为氨基酸转运蛋白有助于它们跨BBB的运输[30]、[31]。然而，由于许多D-氨基酸对大脑功能有直接影响，它们并不适合在体内用于生成H

　　。D-丝氨酸（D-Ser）和D-天冬氨酸在哺乳动物大脑中合成，可作为神经传递的内源性调节剂[32]、[33]、[34]、[35]、[36]。此外，一些蛋白质生成酸的九游科技D-异构体（如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-苏氨酸和D-酪氨酸）在给药后会对大脑功能产生影响[37]。特别是D-丙氨酸，它是体外和体内化学遗传学生成H

　　最常用的底物[13]、[19]、[20]、[38]、[39]，但由于其对基础突触传递的负面影响，不适合作为大脑实验的底物[26]。D-诺瓦林（D-Nva）是一种非蛋白质生成氨基酸的D-异构体，对基础突触传递和突触可塑性均无不良影响[26]。此外，DAAO催化D-Nva氧化脱氨基产生的2-氧戊酸，在细胞内浓度远高于DAAO催化反应预期浓度时，也不会对突触可塑性产生影响[26]。因此，D-Nva似乎是体内化学遗传学生成H

　　的有希望的底物。然而，目前尚不清楚D-Nva是否能够穿透BBB并达到足够量的中枢神经系统神经元，从而在基因改造过、神经元中表达酵母DAAO的小鼠体内生成细胞内H

　　。在本研究中，我们结合了病毒载体介导的DAAO表达和HyPer7（一种基因编码的H

　　的生成情况。为了验证D-Nva能否通过腹腔注射穿过BBB，我们使用Marfey试剂衍生化结合液相色谱质谱法测定了其在大鼠脑组织提取物中的浓度。为了评估化学遗传学生成的H

　　的潜在氧化效应，我们使用拉曼显微光谱技术检测了海马神经元线粒体中的电子传递链（ETC）的氧化还原状态[40]、[41]。

　　实验使用的是2-3个月大的雄性C57Bl/6J小鼠（杰克逊实验室，编号000664，RRID: IMSR_JAX:000664）。小鼠被分组饲养（每笼3-4只），位于谢米亚金-奥夫奇尼科夫生物有机化学研究所的动物设施中。小鼠生活在22-24°C的环境温度下，遵循12小时光照/黑暗周期，并且可以自由摄取食物和水。所有动物操作均符合《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》（1986年，ETS 123）的规定。

　　，我们使用实时光纤光度测量技术，在表达DAAO或不活跃的DAAO(R285A)的小鼠中，测量了腹腔注射D-Nva后超灵敏H

　　传感器HyPer7[19]的荧光变化。小鼠通过立体定向注射AAV载体，将DAAO或不活跃的DAAO(R285A)与HyPer7一起靶向表达在海马区的兴奋性神经元中。

　　我们证明了基于酵母DAAO的化学遗传学工具能够在体内依赖底物生成可检测水平的细胞内H

　　生成工具适合通过饮用水传递DAAO底物来诱导大脑中的慢性氧化应激。拉曼显微光谱分析显示，体内化学遗传学生成的H

　　弗谢沃洛德·V·贝卢索夫（Vsevolod V. Belousov）：

　　亚历山大·A·莫申科（Aleksandr A. Moshchenko）：

　　所有动物操作均符合《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》（1986年，ETS 123）的规定，并得到了谢米亚金-奥夫奇尼科夫生物有机化学研究所的机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号331和364）。

　　pAAV_CaMKIIα-RFP-p2A-DAAO(R285A)-NES

　　pAAV_CaMKIIα-GFP-p2A-DAAO-NES+(wpre-sv40)